北京大学生命科学学院生物动态光学成像中心与首都医科大学附属北京世纪坛医院（北京大学第九临床医学院）肝胆胰外科合作，研发了一种肝癌无创早期诊断新技术——甲基化CpG短串联扩增与测序（MCTA-Seq）。该项技术是通过对患者血浆游离DNA中异常高甲基化CpG岛进行全面测序分析，来实现对肝癌的早期诊断，是癌症诊断方法上的一个突破。研究结果在线发表于10月30日的《细胞研究》（Cell Research）杂志上。

DNA甲基化是指DNA的胞嘧啶（C）被加上一个甲基而形成甲基胞嘧啶的表观遗传修饰，主要发生于CpG二核苷酸。CpG二核苷酸高度聚集于被称为CpG岛的基因组区域，这些区域主要位于基因转录起始处，具有重要的转录调控功能。CpG岛在正常细胞中大多处于去甲基化状态，但在肿瘤细胞中，大量CpG岛会发生异常高甲基化。CpG岛异常高甲基化不仅与肿瘤的发生发展密切相关，而且也是一种非常有前途的肿瘤标志物。

图：封面图片

坏死的癌细胞会将DNA释放到血液中成为循环游离DNA，能否通过检测血液中携带异常高甲基化CpG岛的游离DNA而发现早期癌症呢？虽然早在上世纪九十年代就有学者开始这种尝试，但研究工作一直进展缓慢。其中，一个关键的瓶颈是缺乏能够同时检测大量CpG岛的高通量技术。早期肿瘤释放到外周血中的游离DNA极其微量且呈高度片段化，目前已有的DNA甲基化组检测技术灵敏度均较低，无法满足对其进行高通量检测的要求。

MCTA-Seq技术巧妙地突破了这一瓶颈。通过选择性扩增甲基化CpG短串联CGCGCGG序列和随后进行高通量测序分析，MCTA-Seq可以在一个反应中同时检测到近九千个CpG岛；检测下限可低至1～2个细胞的基因组DNA。

肝癌是全球发病率最高的恶性肿瘤之一，死亡率居第三位。由于慢性乙型肝炎病毒感染者众多，肝癌的发病率在我国一直居高不下。目前，血清甲胎蛋白（AFP）是临床上最常用的肝癌早筛标记物，但有约40%的假阴性率，因此迫切需要研发新的肝癌早筛生物标记物。

研究者采用MCTA-Seq技术共分析了151份临床样本，包括57份癌与癌旁组织样本和94份来自肝细胞癌患者、肝硬化患者及正常个体的血浆样本。在肝癌组织中，他们发现有近九百个CpG岛发生了异常高甲基化。而在小肝癌（≤3cm）患者血浆样本中，则鉴定出近四百个甲基化水平显著增高的CpG岛；进一步提高筛选标准后，获得了四十多个表现最佳的血浆CpG岛标记物。研究发现肝癌患者血浆CpG岛标记物可以分为两类，其中一类部分直接来自肝癌组织，而另一类则由肝癌组织与非癌肝组织共同释放。在小肝癌（≤3cm）患者的血浆中，后一类标记物上升的水平甚至超过了前一类。肿瘤手术切除后，两类标记物均显著下降，表明它们都与肿瘤密切相关。后一组新型血浆CpG岛标记物的发现展示了MCTA-Seq技术无偏见筛选的优势。

通过联合两类血浆CpG岛标记物，MCTA-Seq技术诊断肝细胞癌的灵敏度为94%，特异度为89%。尤为重要的是，MCTA-Seq成功地对本研究中全部15例AFP呈现假阴性的肝细胞癌患者做出了正确的诊断。

图：MCTA-Seq技术检测肝细胞癌的灵敏度

鉴于大多数类型的肿瘤都会发生CpG岛异常高甲基化，MCTA-Seq技术还有望用于其它类型癌症的无创性早期筛查。另外，由于不同类型的肿瘤有独特的甲基化图谱，MCTA-Seq同时还具有识别肿瘤组织来源的潜力。MCTA-Seq的三步建库反应在一个PCR管中即可完成，仅需浅度测序，是一种简便、经济和具有广阔应用前景的游离DNA测序新技术。

北京大学生命科学学院生物动态光学成像中心博士文路，博士研究生李静宜、刘晓萌和北京大学医学部的硕士研究生郭化虎是这篇论文的并列第一作者。生物动态光学成像中心研究员汤富酬、黄岩谊和北京世纪坛医院肝胆胰外科教授彭吉润是该论文的共同通讯作者。汤富酬研和黄岩谊同时也是北大-清华生命科学联合中 心的研究员。该项目得到国家自然科学基金的支持。

汤富酬研究员简介：

北京大学生命科学学院生物动态光学成像中心研究员，博导，Email：tangfuchou@pku.edu.cn

研究领域：

具有自我更新能力和分化潜能的干细胞是哺乳动物胚胎发育过程中以及成体中的关键种类的细胞，对各种干细胞进行深入研究是理解哺乳动物发育、生长机制的关 键，也是将干细胞应用于临床再生医学、治疗人类疾病的前提。本实验室主要围绕人类早期胚胎发育、研究多能干细胞的自我更新能力和多能性调控的分子机理，特 别是表观遗传学调控机理，以及相关的原始生殖细胞发育过程中的表观遗传学重编程机理。利用我们发展的单细胞功能基因组学分析技术（单细胞 RNA-Seq 转录组分析技术、单细胞 DNA甲基化组测序技术等），以及少量细胞染色体免疫共沉淀-高通量测序技术、单细胞基因组测序技术、小鼠胚胎显微操作技术和胚胎干细胞体外定向分化等技 术在单细胞和单碱基分辨率深入分析人类早期胚胎以及多能性干细胞中基因表达网络的表观遗传学调控机理。

（本文整理自北京大学生命科学学院网站）

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