图：花粉样品的左右视角荧光图像

日前，西安光机所瞬态光学与光子技术国家重点实验室（简称：瞬态室）超分辨成像团队研制成功双光子激发激光扫描实时立体显微镜，首次把基于双目视觉的立体显微方法和高分辨率双光子激发激光扫描荧光显微技术结合在一起，实现了对三维荧光样品的高速立体成像，相关研究成果发表在2016年12月刊的PLOS ONE杂志上，并被授权国家发明专利（专利号ZL201210384895.4）。 

当代生命科学研究对光学显微技术提出了越来越高的要求——更高的空间分辨率、更大的成像深度、更快的成像速度。特别是对于生物活体显微成像来说，生物组织对光的散射使得噪声大大增强，严重影响了空间分辨率和成像深度。为了提高成像深度，双光子激发激光扫描荧光显微技术自20世纪90年代提出后被广泛应用于神经成像等领域，但是其逐点扫描的成像方式严重制约了成像速度。因为高分辨率光学显微镜的景深很小，要对样品完成三维成像，通常需要数十层乃至上百层的二维图像进行叠加重建得到，图像采集和处理一般需要数分钟甚至数十分钟，要快速实时地获取和显示三维图像非常困难。 

瞬态室超分辨成像团队在姚保利研究员和叶彤研究员的带领下，以双目视觉原理和贝塞尔光束产生扩展焦场为基础，提出了由四个振镜组成的激光束立体扫描装置，实现了对贝塞尔光束的横向位置和倾角共三个维度的控制，突破了只有两个自由度的传统激光扫描不能实时切换视角的限制。通过对四振镜立体扫描装置的优化设计和控制，实现了对贝塞尔光束的三自由度快速扫描，可在毫秒量级进行双视角切换，从而解决了激光扫描立体显微成像系统中双光路同时成像的技术难题，首次实现了基于双视角实时激光扫描的立体显微成像和显示系统。该系统可对样品进行立体动态成像和实时双目立体观测，其三维成像速度比传统的逐点扫描方式提高了一到两个数量级。该双光子立体显微系统为活体生物的三维实时成像和显示提供了一种新的观测工具。

图：花粉和荧光小球样品的红蓝立体图像（可佩戴红蓝眼镜观看） 

“它可以让我们像观看立体电影一样实时地观测动态的三维微观世界，无需光切片，无需耗时的三维图像重构。”杨延龙博士如此总结这套系统的特点，他负责设计和完成了其中的立体扫描和成像显示的关键部分。“双目视觉成像是非常高效的三维信息获取方式，但是现有的体视显微镜，空间分辨率和景深互相制约，我们利用三自由度扫描的贝塞尔光束进行非线性荧光激发突破了这种限制。” 

这项研究先后在中科院“百人计划”和国家自然科学基金的支持下，从基本原理验证，关键技术突破，到原理样机完成，经历了从基础研究到应用集成的各个环节。目前，课题组正在与国内外相关科研机构开展生物医学应用的合作研究，期望尽快将该项技术应用于生物活体三维快速成像和显示领域。

文章链接：

Yanlong Yang, et al, "Two-Photon Laser Scanning Stereomicroscopy for Fast Volumetric Imaging," PLoS ONE 11(12): e0168885. doi:10.1371/journal.pone.0168885

（本文来源：西安光机所；）

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